A transição da indústria farmacêutica para reagentes em cascata recombinantes (rCR) para teste de endotoxinas bacterianas (BET) representa um avanço significativo em sustentabilidade e confiabilidade. No entanto, a validação abrangente em diversos sorotipos de endotoxinas e plataformas de teste continua sendo essencial para a adoção generalizada.
Em colaboração com a ACC, realizamos um estudo comparativo examinando as características de desempenho de métodos de detecção com microfluidos e tradicionais baseados em placas usando reagentes recombinantes. Essa pesquisa, apresentada na Conferência de Microbiologia Farmacêutica da PDA, demonstra desempenho equivalente dessas plataformas na detecção de vários sorotipos de endotoxinas bacterianas, incluindo endotoxinas de ocorrência natural, a partir de múltiplas fontes bacterianas Gram-negativas.
Nossos resultados fornecem dados críticos de validação que apoiam o uso da tecnologia de rCR com uma plataforma avançada de microfluidos, abordando questões importantes relacionadas à recuperação de sorotipos, comparabilidade da plataforma e desempenho analítico. Os resultados confirmam que os reagentes recombinantes em cascata alcançam recuperação e confiabilidade eficazes em diversas endotoxinas, validando ainda mais sua adequação como uma alternativa robusta aos reagentes tradicionais de lisado de amebócitos de Limulus (LAL) para testes de endotoxinas.
Introdução: tecnologia de rCR e métodos de detecção de endotoxinas
Os reagentes em cascata recombinantes (rCR) representam uma alternativa sustentável ao LAL tradicional para testes de endotoxinas bacterianas. Ao utilizar a tecnologia recombinante, o rCR replica toda a cascata de LAL sem depender de recursos derivados do caranguejo-ferradura, alinhando-se às metas de sustentabilidade do setor. À medida que a adoção de rCR se expande, a validação abrangente em endotoxinas naturais de diversas fontes bacterianas Gram-negativas torna-se cada vez mais essencial.
Este estudo avalia o desempenho do rCR PyroSmart NextGen® em lipopolissacarídeos (LPS) de múltiplas espécies bacterianas Gram-negativas usando três lotes comerciais independentes. Além disso, a investigação compara duas plataformas de detecção — a plataforma Sievers Eclipse BET e as microplacas tradicionais de 96 poços — para avaliar a consistência da recuperação de endotoxinas entre sorotipos e avaliar as características de desempenho de cada plataforma.
Projeto de estudo: comparação de plataformas modernas de microfluidos com o teste tradicional de endotoxinas bacterianas
Objetivos do estudo:
- Avaliar a recuperação de diversos sorotipos de endotoxinas usando o rCR PyroSmart NextGen® da ACC na plataforma Sievers Eclipse BET e em microplacas de 96 poços com o leitor SpectraMax® da Molecular Devices
- Avaliar a comparabilidade da plataforma entre métodos de detecção com microfluidos e tradicionais baseados em microplacas de 96 poços
- Caracterizar parâmetros de desempenho em várias fontes de LPS
Materiais de teste:
- Soluções de LPS criadas a partir de cepas de microrganismos Gram-negativos (KWIK-STIK microbiológicos)
- Padrão de referência de endotoxina (RSE) lote R172R0
- rCR PyroSmart NextGen® (ACC)
Métodos:
Soluções brutas de lipopolissacarídeos (LPS) foram preparadas a partir de monoculturas dos seguintes microrganismos Gram-negativos:
- B. cepacia, derivada do ATCC® 25416™
- E. coli, derivada do ATCC® 8739™
- P. aeruginosa, derivada do ATCC® 10145™
- R. pickettii, derivado do ATCC® 27511™
- S. enterica, derivada do ATCC® 51741™
- S. maltophilia, derivada do ATCC® 13636™
As culturas foram suspensas em água para cultura celular (WFCC), aquecidas, agitadas em vórtices e filtradas através de filtros de seringa de 0,2 μM. As soluções foram diluídas para atingir as respostas alvo de 0,5 a 1,0 EU/mL. Água de torneira também foi coletada e diluída para a mesma meta de EU/mL.
Como controle para o método de extração de LPS, a WFCC foi aquecida, agitada em vórtice e filtrada com a mesma metodologia e testada para interferência e contaminação. A WFCC de controle demonstrou características de desempenho equivalentes às da água reagente de LAL (LRW) nos ensaios.
A endotoxina padrão de referência (RSE, lote R172R0) foi preparada em uma faixa de concentração de 50 a 0,005 EU/mL via diluição seriada e testada como uma curva padrão simultaneamente ao lado de todas as amostras.
Resultados e conclusões:
Equivalência da plataforma BET e características de desempenho de rCR
Esta investigação confirma desempenho equivalente entre a plataforma Sievers Eclipse BET e a metodologia tradicional de placa de 96 poços na detecção de vários sorotipos de endotoxinas bacterianas, incluindo endotoxinas de ocorrência natural. Os dados validam o uso eficaz de reagentes em cascata recombinantes (rCR) da plataforma Eclipse para recuperação confiável em diversas endotoxinas.
A tecnologia de microfluidos centrípetos Eclipse oferece vantagens operacionais, incluindo tempo de ensaio reduzido e menor potencial de erros. Com sensibilidade de 0,005 EU/mL, o tempo médio de reação para RSE na plataforma Eclipse foi de 1,692 segundos, representando uma redução de 37% em comparação com os 2,687 segundos observados com o SpectraMax.
As principais descobertas apoiam a plataforma Eclipse como uma solução em conformidade para testes de endotoxinas, oferecendo:
- Eficiência analítica aprimorada com economia de tempo significativa
- Diminuição da variabilidade por meio do processamento automatizado com microfluidos
- Práticas de teste sustentáveis via compatibilidade com rCR
- Sensibilidade e precisão mantidas com diversas fontes de endotoxinas
Esses resultados contribuem para aumentar as evidências que apoiam a adoção de rCR e plataformas avançadas de microfluidos para aplicações farmacêuticas de controle de qualidade.
Saiba mais sobre Sievers Eclipse
Autores:
- Veronika Wills
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Veronika Wills dirige grupos de serviços técnicos globais na Associates of Cape Cod, Inc. Ela se juntou à equipe em 2007 e, desde então, tornou-se uma especialista mundialmente reconhecida no assunto e palestrante pública sobre testes de endotoxinas e glucanas. Ela oferece uma ampla experiência que é vital para os clientes da ACC quando se trata de suporte técnico de testes de matrizes de amostras complexas, solução de problemas, validações de métodos, investigações e aspectos regulatórios de BET. Mais recentemente, Veronika tem estado fortemente envolvida na avaliação e implementação de tecnologias recombinantes e sua automação. Veronika é mestre em Engenharia Bioquímica pelo Instituto de Tecnologia Química de Praga, República Tcheca.
- Meg Provenzano
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Meg Provenzano é gerente global de produtos para instrumentos de endotoxina Sievers na Veolia. Ela possui mais de 10 anos de experiência na indústria de testes de endotoxinas bacterianas e ocupou vários cargos em controle de qualidade, suporte técnico e gerenciamento de produtos. Antes de ingressar na Veolia, Meg foi gerente de produtos da Charles River Laboratories. Ela tem foco no cliente e gosta de resolver problemas na prática, seja para questões técnicas, assistência de ensaio ou software. Meg é bacharel em Ciências Marinhas e Biologia pela Coastal Carolina University, onde se concentrou na pesquisa populacional de golfinhos-nariz-de-garrafa.
- Jake Vincent
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Jake Vincent é especialista em biodetecção e pesquisador líder avançado do grupo de pesquisa e desenvolvimento Sievers da Veolia, especializado no desenvolvimento de instrumentação analítica de biodetecção. Um dos principais colaboradores do analisador de endotoxinas Sievers Eclipse, Jake foi responsável por projetar os padrões pré-depositados apresentados no dispositivo de consumível de microfluidos. Jake foi coautor da pesquisa sobre detecção de endotoxinas com microfluidos, "Miniaturization, Parallelization, and Automation of Endotoxin Detection by Centrifugal Microfluidics", que foi publicada na Analytical Chemistry. Antes de ingressar na Veolia, Jake contribuiu para o desenvolvimento de métodos analíticos para testes de vacinas contra flavivírus nas vacinas Inviragen e Takeda, incluindo testes de ensaios clínicos para a vacina contra a dengue, Qdenga. Ele é formado pela Colorado State University.