Como parte da fabricação de medicamentos parenterais ou dispositivos médicos, a conformidade com os padrões regulatórios para controle de contaminação é um passo fundamental para garantir a segurança do paciente. Este artigo detalhará o Capítulo <85> da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP) intitulado "Teste de Endotoxinas Bacterianas" (BET).
O que é a USP <85> e por que ela é importante?
USP <85> descreve os requisitos de compêndio para testes de endotoxinas bacterianas. Fornece as metodologias para detectar ou quantificar endotoxinas usando lisado de amebócitos, um composto extraído de espécies de caranguejos-ferradura como Limulus polyphemus ou Tachypleus tridentatus. Esses tipos de lisado são tipicamente referidos como Limulus Amebocyte Lysate, ou LAL, ou Tachypleus Amebocyte Lysate, ou TAL.
Por que testar para endotoxinas bacterianas?
Endotoxinas são biocontaminantes derivados da membrana celular externa de bactérias Gram-negativas. Embora não sejam organismos vivos, são pirogênios altamente perigosos que podem produzir febre no corpo ao contornar as defesas digestivas normais. Além disso, podem causar queda grave da pressão arterial, falência de órgãos, choque séptico ou até mesmo a morte, em determinadas circunstâncias.
Como as endotoxinas persistem mesmo após os processos padrão de higienização e esterilização, testes rigorosos são absolutamente vitais para produtos e dispositivos de entrega que entram em contato com a corrente sanguínea ou o líquido espinhal.
Quem é impactado pela USP <85>?
Órgãos reguladores como a Federal Drug Administration (FDA) dos EUA e a Agência Europeia de Medicamentos (EMA) exigem testes de endotoxina para garantir que os produtos não causem reações pirogênicas como as descritas acima. Seus regulamentos se aplicam a vários setores, incluindo:
- Fabricantes de produtos farmacêuticos que produzem medicamentos parenterais que são administrados por métodos intravenosos, intramusculares e intratecais.
- Fabricantes de dispositivos médicos cujos produtos entram em contato com a corrente sanguínea.
- Fabricantes de produtos de saúde animal que produzem artigos veterinários em contacto com o sangue.
Nota - esta lista não é completa.
Métodos de detecção de endotoxinas USP <85>
Além dos requisitos compendiais da USP <85> delineando metodologias para detectar ou quantificar endotoxinas usando LAL, o capítulo também descreve fatores que podem impactar os resultados criando inconsistências ou resultados imprecisos. Embora não detalhe como gerenciar ou mitigar esses aspectos, destaca a importância do desenvolvimento completo do método como parte da validação. Informações sobre interpretação e aplicação de requisitos para USP <85> podem ser encontradas em USP <1085> "Guidelines on Endotoxins Tests".
Métodos de detecção
USP <85> detalha três técnicas comuns para testes de endotoxinas e como elas geram dados; os reagentes necessários necessários; e como garantir que o ensaio seja executado de forma a garantir que os procedimentos e materiais não contribuam para possíveis contaminações ou resultados errôneos.
Os três métodos são:
- Técnica de Gel-Clot: Este método qualitativo ou semiquantitativo baseia-se na coagulação do reagente lisado na presença de endotoxinas.
- Técnica turbidimétrica: Ensaio fotométrico que mede o desenvolvimento de turbidez (nebulosidade ou mudança na opacidade) após a clivagem de um substrato endógeno.
- Técnica cromogênica: Ensaio fotométrico baseado no desenvolvimento da cor após a clivagem de um complexo peptídeo-cromógeno sintético.
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Adequação do método BET e adequação específica do produto por USP <85>
A adequação do método é um processo de validação que confirma que um método de teste de endotoxina bacteriana é apropriado e confiável para um produto ou aplicação específica, antes de ser usado para testes de rotina.
O que deve ser considerado no desenvolvimento da adequação do método?
Os ensaios de endotoxinas são altamente sensíveis. O desenvolvimento e a adequação do método geralmente são específicos do produto para documentar que um medicamento, dispositivo ou matéria-prima não interfere na reação e seu método de detecção para garantir resultados válidos. A adequação adequada do método garante testes de endotoxina bacteriana confiáveis, válidos e em conformidade com os regulamentos.
Critérios de aceitação
Os limiares de segurança nos produtos farmacêuticos não são "solução genérica". Aspectos como dosagem, tempo de uso e entrega do produto entram nos critérios de aceitação.
Os fabricantes devem calcular um limite de endotoxina (EL) para cada produto com base em como ele entra no corpo. A fórmula utilizada é:
EL = K / M
Nessa equação, K representa o limite de tolerância do corpo (o "limiar de segurança"), enquanto M representa o "pior cenário" – a dose máxima de droga que um paciente pode receber por quilograma de peso corporal por hora.
O fator K muda drasticamente com base na via de administração. Por exemplo, produtos intravenosos (IV) ou intramusculares (IM) são definidos como drogas que entram na corrente sanguínea ou nos músculos. O limite de tolerância para produtos IV e IM é maior, pois o risco é menor devido ao tipo de entrega. Em comparação, as drogas injetadas diretamente na medula espinhal ou no cérebro, chamadas de drogas intratecais (IT), normalmente têm um limite de tolerância menor, pois o risco de reação adversa é maior. Isso significa que um medicamento espinhal deve conter uma carga de endotoxina menor do que um gotejamento IV padrão.
Além disso, há cálculos adicionais que levam em conta se um medicamento é uma dose única ou um gotejamento contínuo, pois a taxa de entrega muda o perfil de risco. Esses cálculos levam em conta fatores do paciente, como peso ou tipo de paciente. A matemática baseada no peso também é o motivo pelo qual medicamentos pediátricos e veterinários geralmente têm ELs significativamente mais baixos, já que pacientes menores têm um limiar mais baixo para exposição a endotoxinas.
Isso fará parte dos cálculos de Diluição Máxima Válida (MVD), conforme descrito abaixo.
Sensibilidade LAL
O lisado tem vários fatores que contribuem para a inconsistência na sensibilidade.
O LAL não é um único composto, mas uma mistura de enzimas produzidas pelos amebócitos, com cada uma contribuindo para a reação em cascata. Devido ao fato de ser produzida na natureza, essas enzimas podem variar em quantidade e sensibilidade e não têm consistência comum aos reagentes fabricados.
A cascata LAL é um sistema de amplificação enzimática altamente sensível que detecta endotoxinas através de uma série de ativações enzimáticas e permite a detecção rápida e específica de endotoxinas. A reação em cascata é o motivo pelo qual o teste LAL é o padrão ouro para detecção de endotoxinas bacterianas em indústrias regulamentadas.
É importante considerar a variabilidade potencial, pois ela impacta os resultados e compromete a reprodutibilidade nos experimentos. A variação é um fator nos cálculos de diluição máxima válida (MVD), que é rotulada como λ.
O LAL começa a reagir e degradar-se imediatamente após a reconstituição. Enquanto a refrigeração irá retardar a atividade, mas não parar a degradação. Essa variação deve ser considerada em todos os ensaios e pode ser realizada das seguintes maneiras:
- * Uma curva padrão: Uma calibração da reatividade do reagente atual usando um mínimo de 3 pontos (ou 4 para o método gel-clot).
- * Controles de produtos positivos (PPC): amostras com uma quantidade conhecida de endotoxina para provar que o teste pode realmente detectá-la dentro daquele medicamento específico.
- * Controles negativos: LAL misturado com água reagente LAL (LRW) para definir uma linha de base.
A instabilidade do LAL pode ser observada em controles negativos. Se lhes for dado tempo suficiente, acabarão por reagir. Essa sensibilidade inerente é a razão pela qual o teste é tão eficaz, mas exige disciplina processual.
Limite de endotoxina e diluição máxima válida (MVD)
A diluição máxima válida (MVD) é a diluição máxima admissível de uma amostra na qual o limite de endotoxina pode ser determinado. Ele leva em consideração tanto o cálculo do limite de endotoxina quanto a sensibilidade ao LAL, mas fornece o fator de diluição para evitar interferência.
MVD = (Limite de Endotoxina (EL) × concentração da Solução da Amostra)/(λ)
λ é a sensibilidade marcada do lisado ou a concentração mais baixa utilizada na curva padrão.
Esse cálculo leva em conta que as amostras podem conter substâncias que inibem a detecção de endotoxinas (causando falsos negativos) ou a potencializam (causando falsos positivos).
Materiais, acessórios e seu impacto nos testes de endotoxinas
A fonte de interferência potencial vai além da amostra em si, e o manuseio adequado da amostra é uma consideração que afeta a precisão do teste.
Os materiais utilizados para coleta e armazenamento de amostras são oportunidades para introduzir contaminação. A USP <85> descreve que:
- Hardware projetado para reutilização, como bandejas de metal, deve ser despirogenado.
- Itens como pontas de pipeta, tubos de diluição e microplacas devem ser examinados para confirmar que estão livres de endotoxinas detectáveis, seja com base no Certificado de Análise (CoA) de um fornecedor ou por meio de testes internos.
- Certos materiais, como pipetas sorológicas de plástico, são conhecidos por causar interferência e devem ser evitados.
Recomenda-se que os protocolos de testes evitem o uso de acessórios que contenham plásticos, como o polipropileno, pois ele é conhecido por adsorver endotoxinas e pode causar subnotificação.
Quando se trata de endotoxinas, um falso negativo é especialmente perigoso para a segurança do paciente, porque as reações pirogênicas podem ser graves.
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Contaminação por Beta Glucan
As beta-glucanas (β-glucanas) podem ser introduzidas quando material vegetal ou fungo é introduzido como parte da preparação da amostra, como usando uma ponta de pipeta filtrada.
Beta-glucanos são carboidratos complexos compostos por moléculas de glicose ligadas por ligações β-glicosídicas. Também conhecidos como polissacarídeos, eles ocorrem naturalmente em inúmeros organismos, incluindo leveduras, fungos, bactérias, algas e cereais como aveia e cevada. Fungos e leveduras contêm as maiores concentrações de Beta-Glucanas, e sua prevalência significa que o risco de contaminação é considerável.
Os beta-glucanos interferem nos resultados, causando resultados falso-positivos ao ativar o LAL por uma via diferente das endotoxinas.
Superando a interferência do BET
A USP <85> determina que fatores interferentes sejam considerados como parte do desenvolvimento do método, e a recuperação deve estar dentro da faixa de 50% a 200%. Se a recuperação estiver fora desse intervalo, a interferência estará presente.
Muitas vezes, a interferência pode ser superada por:
- Diluir a amostra, mas a diluição não pode exceder o MVD
- Aplicação de tratamentos validados adequados, como filtragem, neutralização, diálise ou tratamento térmico
- Usando um tampão de bloqueio de glucanos se beta-glucanos estão presentes, como LAL às vezes pode reagir a glucanos além de endotoxinas
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Integridade de dados e BET
Os testes tradicionais, particularmente com o método gel-clot, são manuais tanto nas operações quanto na determinação do ponto final. Para este teste, a criação de um coágulo é confirmada com a inspeção visual de um tubo. Essa natureza manual não é apenas demorada, mas é aberta à interpretação, tornando-a propensa a erros humanos. Isso pode comprometer a integridade dos dados.
Para mitigar esses riscos, os laboratórios estão recorrendo a ensaios com dados quantitativos. Essas plataformas fazem várias leituras usando software compatível e fornecem transmissão de dados segura, trilhas de auditoria completas específicas para ensaios e estrita adesão aos recursos de conformidade de integridade de dados 21 CFR Parte 11 e ALCOA+. Além disso, essas opções fornecem uma variedade de opções de automação, incluindo diluição e pipetagem de amostras.
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Autores:
- Meg Provenzano
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Meg Provenzano é gerente global de produtos para instrumentos de endotoxina Sievers na Veolia. Ela possui mais de 10 anos de experiência na indústria de testes de endotoxinas bacterianas e ocupou vários cargos em controle de qualidade, suporte técnico e gerenciamento de produtos. Antes de ingressar na Veolia, Meg foi gerente de produtos da Charles River Laboratories. Ela tem foco no cliente e gosta de resolver problemas na prática, seja para questões técnicas, assistência de ensaio ou software. Meg é bacharel em Ciências Marinhas e Biologia pela Coastal Carolina University, onde se concentrou na pesquisa populacional de golfinhos-nariz-de-garrafa.
- Sidnei Jannetta
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é gerente de Marketing na Veolia, com foco na linha de instrumentos analíticos Sievers. Sydney tem apoiado os clientes da Sievers nos últimos dez anos com experiência em aplicações de carbono orgânico total (COT) e endotoxinas. Ela forneceu serviços de desenvolvimento de métodos e testes de viabilidade para fabricantes farmacêuticos e apresentou em mais de 20 conferências nacionais. Sydney é bacharel em Química pela Universidade do Colorado do Norte.
- Lindsey Wohlman
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é especialista de Marketing na Veolia e oferece suporte à linha de instrumentos analíticos Sievers. Ela colabora estreitamente com engenheiros, cientistas e especialistas em produtos para desenvolver conteúdo que transforma informações técnicas em insights práticos para clientes B2B e partes interessadas. Sua experiência como profissional de marketing digital full-stack em tecnologia, software e manufatura lhe deu um profundo apreço pelo papel que a comunicação clara desempenha na condução da compreensão e na construção de confiança. Lindsey é bacharel pela Universidade do Colorado.