A maioria dos fabricantes de produtos farmacêuticos e dispositivos médicos de hoje utiliza limulus amebocyte lysate (LAL) — o sangue de caranguejos-ferradura — para testar a endotoxina bacteriana. O teste é fundamental para detectar contaminantes perigosos e potencialmente mortais, mas, do ponto de vista da sustentabilidade, pressiona a população de caranguejos-ferradura. Os caranguejos são o reagente natural de detecção de endotoxinas mais sensível e incomparável do planeta. A maioria dos que foram coletados e sangrados pela indústria biomédica é, conforme exigido pela Planta de Manejo Pesqueiro (PMF), liberada viva para a água de onde foram coletados; no entanto, uma parte desses caranguejos morre com o procedimento1. Por essa razão, métodos alternativos de endotoxinas bacterianas têm evoluído nos últimos anos. O fator C recombinante (rFC) e os reagentes em cascata recombinantes (rCR) são dois métodos alternativos que não utilizam sangue de caranguejo-ferradura.
O rFC é a primeira enzima de coagulação no mecanismo de coagulação sanguínea do caranguejo-ferradura, e um clone desse fator C é usado para o método rFC. Ele funciona com um leitor de fluorescência amplificando um substrato fluorogênico para detectar a presença de endotoxina. A FDA reconheceu o rFC como um método alternativo, mas exige testes de equivalência aos métodos BET compendiais mais comuns, de acordo com os requisitos de <85>Teste de endotoxinas bacterianas USP e do capítulo <1225>Validação de procedimentos compendiais2 USP.
Os reagentes em cascata recombinantes, ou rCR, utilizam os mesmos fatores que os reagentes LAL tradicionais encontrados no sangue do caranguejo-ferradura, contudo, por utilizarem um processo de fabricação recombinante3, são considerados um método alternativo. O uso de um reagente recombinante contém todos os fatores de coagulação e usa um ensaio cinético tradicional em um leitor de absorção, tornando-o um teste livre de animais para BET. As empresas que adotam esse método de ensaio também devem passar pelos mesmos testes de validação/equivalência que o rFC.
Embora esses métodos sejam mais sustentáveis para a população de caranguejos-ferradura, validar e implementar um método alternativo para BET pode ser demorado e rigoroso, e deixar muitas empresas procurando uma opção mais simples, mas também sustentável, para testar produtos para endotoxina.
A plataforma de teste de endotoxinas bacterianas (BET) Sievers Eclipse é uma solução que oferece vantagens significativas em termos de redução de LAL e adesão ao compêndio. Embora não seja um método alternativo, ao realizar um protocolo IQ/OQ/PQ completo e testes e validação robustos semelhantes aos requisitos da USP <1225>, os usuários terão total confiança em sua validação. O Eclipse usa LAL de caranguejo-ferradura disponível comercialmente, licenciado pela FDA, mas reduz o uso de LAL em até 90% em comparação aos métodos tradicionais de LAL, como a placa de 96 poços e a dosagem por gel. No desenvolvimento do Eclipse, uma microplaca ultramoderna foi projetada para facilitar a dispersão precisa e rápida de LAL e amostras usando força centrípeta, câmaras de dosagem e canais de microfluidos. O sistema de microfluidos usa a mesma bioquímica dos ensaios tradicionais de endotoxinas, mas com mínimo esforço prático, maior constância e consumo de LAL drasticamente reduzido em até 90%, como mencionado.
A plataforma de teste de endotoxinas bacterianas (BET) Sievers Eclipse está rapidamente se tornando um método de teste BET de escolha porque permite que os fabricantes de produtos farmacêuticos e dispositivos médicos protejam recursos naturais valiosos e cumpram metas de sustentabilidade, ao mesmo tempo que cumprem os rigorosos requisitos analíticos e regulamentares da farmacopeia global harmonizada USP <85>, EP 2.6.14 e JP 4.01.
Comparação de métodos de teste LAL
Autor: Hayden Skalski– especialista de Aplicação de Produtos de Ciências da Vida, Veolia Water Technologies & Solutions, Sievers Instruments
Hayden é especialista de Aplicação de Produtos de Ciências da Vida para a linha de produtos Sievers Instruments, especializada em testes de endotoxinas bacterianas (BET). Hayden tem mais de 8 anos de experiência na indústria farmacêutica e em microbiologia de controle de qualidade e apresentou vários tópicos relacionados a testes de endotoxinas. Anteriormente, Hayden ocupou cargos na na Charles River Laboratories, na Regeneron e na Novartis, validando e executando protocolos de desenvolvimento de métodos para testes de endotoxinas, fornecendo suporte ao cliente, solução de problemas e suporte a testes de produtos de alto volume. Hayden é bacharel em Biologia pela Universidade de Albany (SUNY).
- Referências
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1. Comissão de Pesca Marinha dos Estados do Atlântico. (s.d.). Caranguejo-ferradura. Retirado de http://www.asmfc.org/species/horseshoe-crab
2. Departamento de Saúde e Serviços Humanos da Agência de Administração de Medicamentos e Alimentos dos EUA. (junho 2012). Orientação para a indústria: testes de pirogênio e endotoxinas – perguntas e respostas
3. Associates Of Cape Cod Incorporated. (s.d.). Instruções de uso de reagente LAL recombinante PyroSmart NextGen™.